L'area comunale e il colle su cui oggi sorge il capoluogo comunale conobbero un denso popolamento, come tutta la Valdichiana, già in epoca villanoviana ed etrusca. La zona cadde sotto Roma durante il I secolo a.C., grazie alla conquista da parte di Silla. Un contingente romano, agli ordini del console Lucio Licinio Lucullo, si stabilì proprio sul colle ove oggi sorge il borgo e qui fondò un castrum che, in onore del console, venne ribattezzato Lucinianum.

La felice collocazione geografica fece della cittadina un crocevia tra le città di Arezzo, Siena e Perugia. In effetti le tre città si contesero ripetutamente Lucignano che, dopo il periodo di libero comune, fu conquistato prima da Arezzo e poi da Perugia. Il passato perugino è tutt'oggi visibile nello stemma comunale, che consiste appunto di un grifone alato (più una stella, per indicare che la città sorge in collina).

Il declino di Arezzo, dopo la sconfitta a Campaldino contro Firenze (1289), e la progressiva sottomissione di Perugia allo Stato Pontificio, favorirono nel XIV secolo l'entrata in gioco di Siena, che occupò Lucignano. Il centro fu munito di una notevole cinta muraria (tutt'oggi perfettamente conservata) e di una rocca turrita a presidio della città. Il controllo senese perdurò fino al 1554, quando Firenze espugnò Siena, subentrandole nei territori dominati. Come in tutte le città medicee fu realizzata la Fortezza, ma venne pure proseguito lo sviluppo urbanistico, dando a Lucignano quell'aspetto tipicamente tardo-medievale che tutt'oggi possiede.